近年，细胞与基因治疗研究火热，2015年开始，中国CGT产品的临床试验数量逐年增长，目前已成为开展数量仅次于美国的地区。CGT等新兴技术的快速发展推进了药品审评审批及监管制度的进步与革新。本期活动聊一聊CGT等新兴技术治疗产品的监管科学问题，如何根据CGT产品的特点创新监管技术？
上海市药物研发协同创新中心与浦东国际人才发展中心共同举办第48期Science café活动。本期活动特别邀请了上海市药品和医疗器械不良反应监测中心王方敏研究员、赫尔辛基大学娄艳茹教授和上海市食品药品安全研究会副会长高惠君研究员，与大家共同探讨“细胞基因治疗与监管科学”。
嘉宾精彩报告总览
● 干细胞体内应用的研究与挑战
· 干细胞治疗产品的三方面考量
· 基因编辑技术
· 非异源性生物材料
· 干细胞成熟性问题
● 细胞治疗药物的研发与监管
· 细胞治疗药物的研发概况
· 国内外监管情况
· 挑战与展望
01干细胞体内应用的研究与挑战
娄艳茹教授从干细胞治疗产品研发的三个重要方面开始，介绍了干细胞治疗产品的关键技术和问题挑战，并分享了团队探索干细胞培养技术的经验与成果。
干细胞治疗产品的三方面考量
干细胞作为治疗药物需要满足药品研发的三要素：有效性、安全性和质量可控。研发满足三要素需要从干细胞、试剂和辅料三个方面进行考虑。
首先是干细胞，干细胞治疗药物的有效性与干细胞的成熟性直接相关。干细胞是尚未成熟的细胞，它能分化成有功能的细胞，这些功能细胞即是再生医学领域用于疾病治疗的产品。因此，干细胞衍生细胞的功能性直接影响到干细胞治疗产品的有效性。
其次是干细胞培养的试剂，试剂与干细胞产品的安全性和质量控制密切相关。有些干细胞需要进行修饰来达到治疗目的，如基因编辑的修饰，基因编辑的引入会对干细胞的安全性引起额外的安全问题。另外，细胞类产品与CHO细胞培养一样需要考虑培养基成分，不同之处在于，干细胞培养还需要考量细胞外基质和生物材料等基质微环境的非异源性和chemically defined因素，干细胞的培养和后续的分化过程均受基质微环境影响。此外，在干细胞分化过程中可能会利用类器官技术，该技术目前尚有缺陷，比如不均匀性和不重复性等，这也会影响到干细胞的质量可控。
第三是辅料，生物材料不只是试剂，也可充当药物递送的载体，也是干细胞治疗药物研发的重要考量。
基因编辑技术
基因编辑技术在干细胞治疗药物研发中具有广泛应用，主要目的是通过基因编辑技术纠正引起疾病的基因和制备通用型干细胞产品。通用型干细胞的研发可以应用于各种疾病的治疗，优点是可降低成本、扩大生产、应用便捷 。例如，利用基因编辑技术敲除引起免疫排斥反应的基因，制备的干细胞可用于异体患者（allogeneic）。
团队聚焦在CRISPR-Cas9基因编辑技术研究，该技术基于两种成分：核酸内切酶Cas9和向导RNA（Guide RNA，gRNA），gRNA是crRNA和tracrRNA组合形成的二聚体，gRNA上有一段CRISPR 转录RNA序列（CRISPR-derived RNA，crRNA），它能够和靶向的DNA序列互补，引导Cas9特异性内切DNA序列。
CRISPR-Cas9基因编辑在人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）中的编辑效率较低，因此团队聚焦探索提高gRNA和Cas9转导效率的新方法。递送进入细胞的Cas9有三种形式：转染Cas9的DNA、mRNA和蛋白质。转染DNA需要进入细胞核后经过转录，再在胞质中形成Cas9，后回到细胞核内进行DNA剪切编辑，整个过程需要经过细胞膜和核膜两层屏障。转染蛋白质也需要经过细胞膜和核膜两层屏障。转染mRNA过程仅需经过一次细胞膜屏障，进入细胞质中即可翻译成Cas9内切酶，随即进入核内发挥编辑作用。转导gRNA的过程较为复杂，由于gRNA是一个短RNA序列，进到细胞内不稳定，容易被降解。为提高gRNA和Cas9转导效率，团队设计了三种方案：第一种方案是gRNA和Cas9的mRNA一同转导到细胞中进行基因编辑；第二个方案是Cas9的mRNA加入一种抵抗puromycin的Tag基因，转染后可筛选转染成功的细胞，以增加基因编辑效率；第三种方案是先转导Cas9的mRNA，再将gRNA导入细胞中。当Cas9 mRNA翻译成蛋白质后，Cas9和gRNA结合，gRNA结构被保护起来，降低了降解风险，提高了编辑效率。团队研究发现第三种方法可大大提高Cas9介导的基因敲除效率，该结论也通过蛋白质的表达得到了验证。进一步研究了更复杂的基因编辑，试验表明该方法不仅可切除长片段基因序列，还可进行双靶基因的敲除，并且敲除效率大大提高。因此，团队总结依次递送Cas9 mRNA和gRNA，并结合puromycin筛选，可有效提高Cas9蛋白在hESCs和hiPSCs中的编辑效率，与传统转导方法相比，该方法可提高双等位基因靶向效率，最高可达76.5%，此外，具有较低的脱靶和细胞毒性。这种非整合基因编辑方法可用于制备体内应用的多能干细胞，如通用型干细胞产品。
非异源性生物材料
非异源性生物材料作为细胞外基质材料是开发干细胞产品的非常重要考量因素。传统hESCs和hiPSCs的3D细胞培养和分化是用Matrigel材料，Matrigel则因动物来源，具有病原微生物等安全风险，且成分不稳定，存在批次差异和质量不可控等缺陷。因此，团队开发了两种生物材料，第一种是纳米纤维化纤维素（nanofibrillar cellulose，NFC）水凝胶，用于3D细胞培养。水凝胶成分是纤维素，类似于植物的细胞壁成分，它的直径分布为7纳米到80纳米，大多数在20~40纳米之间。与Matrigel相比，NFC具有非异源性、成分单一和质量可控等特点，另外，水凝胶的植物来源，无病原微生物，不会对干细胞产生毒性。经一系列研究表明，NFC水凝胶可维持细胞的干性；支持其他类型细胞形成类器官，如肝祖细胞HepaRG；还可作为非异源性生物材料用于干细胞培养。此外，研究显示，纤维素酶可以降解NFC 水凝胶，但不影响3D干细胞结构和干性，移植时可先降解水凝胶再移植，避免材料进入体内。
第二种材料是层黏连蛋白（Laminin）511和521，用于肝向分化的材料。团队长期致力于hESCs和hiPSCs体外分化成肝脏细胞的研究，为满足肝细胞体内或体外的应用。肝脏是药物代谢的主要器官，在体外，肝细胞可应用于药物的研发，包括用于测定药物的代谢和药物的肝毒性；在体内，肝细胞可为需要器官移植的患者提供细胞移植。传统hESCs和hiPSCs的培养和分化是用Matrigel材料，然而Matrigel不适合体内应用。因此，团队探索开发一种可体内培养和分化干细胞的生物材料，即层黏连蛋白（Laminin）511和521。Laminin 511和521作为肝祖细胞发育阶段特异性细胞外基质成分，既可有效诱导多能干细胞的肝向分化，还可以替代Matrigel作为非异源性生物材料用于干细胞分化。
干细胞成熟性问题
目前，人多能干细胞体外分化的最大问题是成熟性问题，人多能干细胞体外分化产生的细胞属于胎儿期的细胞（fetal cells），其功能低于成人细胞的功能，而功能直接影响着再生医学治疗的有效性，且具有一定致瘤性。因此，提高人多能干细胞的成熟性至关重要。
甲状腺激素是人体内非常重要的激素，在胚胎/胎儿早期发育过程中，大脑、心脏和骨骼肌中前体细胞的增殖需要低水平的甲状腺激素，而从妊娠中期到胎儿出生早期，甲状腺激素水平增加促进细胞分化以及器官成熟。因此，团队基于甲状腺激素功能，设计了甲状腺激素对干细胞衍生的肝细胞的功能性影响。研究发现，通过选择性调节肝脏特异性标志物，甲状腺激素可以提高hPSC来源的肝细胞的成熟性，但还需要更多的研究来证实甲状腺激素在肝脏成熟中的有益作用。
02 细胞治疗药物的研发与监管
王方敏研究员介绍了细胞治疗药物的国内外研发概况和相关监管政策法规以及面临的挑战。
细胞治疗药物的研发概况
细胞治疗研究在早些年进展缓慢，直至2012年首个接受CAR-T细胞疗法的儿童癌症患者被治愈的案例出现，被业界广泛关注并引发了近年来的细胞与基因治疗研究热潮。
细胞治疗药物的种类包括干细胞类，如诱导多能干细胞（iPSC，Induced Pluripotent stem cells）、间充质干细胞/基质细胞（MSC，Mesenchymal stem/stromal cells ）、胚胎干细胞（ESC，Embryonic stem cells）、造血干细胞（HSC，Hematopoietic stem cells）等；免疫细胞类，如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T， Chimeric Antigen Receptor T cells）、CAR修饰的自然杀伤细胞（CAR-NK， Chimeric Antigen Receptor Natural Killer cells ）、工程化修饰受体的T细胞（TCR-T，engineered T Cell Receptor T cells ）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，Tumor-Infiltrating Lymphocyte）、树突状细胞（DC，Dendritic Cells）、单核细胞（PBMC，Peripheral Blood Monoculear Cell,）等；以及其他体细胞类，如成纤维细胞、角质形成细胞、软骨细胞等。
细胞治疗的临床研究起步较早，在80年代已有细胞治疗的临床试验登记，1992年出现了基因修饰技术的突破和第一代CAR-T细胞的研发。从临床试验登记数量来看，根据clinicaltrial.gov官网信息统计，中国的细胞治疗产品临床试验总体数量仅次于美国，其中CAR-T类产品的临床试验数量已经超越美国，位居全球首位。根据国内CDE的临床试验登记情况，目前已登记有近110项细胞治疗药物临床试验项目，数量逐年攀升，治疗领域也比较多样化，其中肿瘤治疗领域占比最大，长三角区域占全国的半壁江山。
目前，根据官网公开数据显示，美国、欧盟和中国分别有22、12和2个细胞治疗产品已获批上市（不含已撤市品种）。上述产品涵盖了干细胞类、免疫细胞类和其他体细胞类。总体来看，美国批准的干细胞类产品更多，欧盟批准的免疫细胞和体细胞类产品更多；而已上市的同品种在欧盟获批的时间略晚于美国，但撤市要比美国更多或更早，可以看出美国对先进疗法更为宽容。
国内外监管情况
◽ 美国
美国将细胞治疗产品归属于细胞与基因治疗（CGT），法规中称为再生医学产品（HCT/Ps）。FDA负责CGT产品审评审批的部门是生物制品评价与研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research, CBER）下设的组织与先进治疗办公室（Office of Tissues and Advanced Therapies，OTAT）。为了加大对细胞与基因治疗产品的鼓励支持，应对该领域的爆发性增长，FDA于近期专门成立了CBER的第一个超级办公室——治疗产品办公室（Office of Therapeutic Products，OTP）。
在鼓励政策方面，美国在2015年出台的《21世纪治愈法案》基础上，FDA于2017年出台了《再生医学先进疗法》（Regenerative Medicine Advanced Therapies, RMAT）认定政策，规定通过认定可享受一系列优惠政策。各州也出台了一些地方法规，如德州出台了《干细胞法案》，允许未经FDA批准的产品可以在该州试用。2018年，美国颁布了《尝试权法案》，允许医生为患者开具临床试验期间的细胞治疗产品处方。近两年，美国还出台了《国家生物技术和生物制造计划》和《美国生物技术和生物制造的明确目标》等政策，将细胞与基因治疗的发展列入国家战略。
美国对CGT产品监管的法律包括《美国食品、药品和化妆品法案》和《公共卫生服务法案》。主要的法规包括《联邦法规21章》（21 Code of Federal Regulations, 21 CFR）的第1271、600、312、211部分，以及《人体细胞及组织产品HCT/Ps的管理规定》。细胞组织被分为PHS351与PHS361两类产品管理，其中PHS351类产品需要被CBER审批监管的产品，PHS361类产品可直接作为医疗技术在医院进行临床应用。另外，FDA出台了一系列针对细胞与基因治疗的指南文件，为行业提供指导并加强监管。
◽ 欧盟
欧盟将细胞治疗产品归属为先进治疗药物（ATMP）产品。早在2007年就出台了专门的法规Regulation (EC) No 1394/2007，并颁布了多项指南、观点和相关文件以推动ATMP产品的高效开发，并在2009年批准了第一个细胞治疗产品上市。细胞治疗产品的注册适用集中审评程序，由EMA的先进疗法委员会负责审评，欧盟委员会负责最终审批。各个成员国对细胞治疗产品有着自己的监管要求，包括卫生和药监的监管要求，各有差异。
◽ 中国
我国药监部门在1999年颁布的《新生物制品审批办法》中已对细胞和基因治疗药品的申报有专门的要求。随着该领域的技术发展，2015年国家卫生和药监部门联合出台了《干细胞临床研究管理办法》，将细胞治疗研究纳入到了规范化管理体系中。目前，国内对细胞治疗实行“双轨制”的监管机制，一方面，干细胞技术和体细胞技术可以作为由医疗机构主导的生物医学新技术，根据相关法规，由卫健委进行监管；另一方面，细胞治疗产品可以作为药品，由药品监管部门进行临床试验和上市许可的审评审批和监管。药监部门已经建立了覆盖非临床研究、临床试验、生产、经营和药物警戒的全生命周期质量管理规范，并在近年来出台了一系列的技术指导原则来促进和规范细胞治疗产品的研发和生产。2017年CDE发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》，对细胞治疗产品从药学到临床研究明确了系统性的技术要求。2019年以来，新修订的《药品管理法》、《药品注册管理办法》和相关配套文件和技术要求，以及监管科学取得的大批研究成果相继颁布，有力促进了行业发展。2021年国内首个CAR-T产品获批上市。
挑战与展望
细胞治疗领域的机遇与风险并存，既有巨大的临床潜力和广阔前景，也面临着众多挑战，在实体瘤治疗及供货时间等方面的研究仍有待突破。该领域的技术发展快，研发难度大。细胞治疗产品作为“活”的药物，其研发和生产需要与临床紧密协同，需要对从临床采集细胞到最终在临床回输细胞进行全流程的质量管理；而由于患者个体差异、细胞的异质性、材料量和产量有限、无法终端灭菌及不耐储存等特点，细胞治疗产品的研发、生产和监管都面临很多与其他药品不同的挑战。研究机构在开展IIT研究阶段，如果能尽早确定制备工艺，按GMP要求开展临床样品制备，并严格按GCP规范开展研究，确保数据可靠性，加强与审评部门的沟通，利用IIT研究数据为药品审评提供依据，将有助于加快产品研发和注册上市进程。监管部门需要加强监管科学研究，不断开发出前沿技术的新标准、新方法和新工具，提升药品监管能力，加快推动国内CGT产业的创新发展。此外，CGT的发展还需要社会各界共同努力与合作，以临床价值为导向，加快好产品的研发上市，并确保产品的安全有效和质量可控，真正服务于患者用药。
往期回顾
Science Café 第47期：人工智能在生物医药领域新应用