小核酸药物是近年发展快速的新型药物之一，自获批上市以来受到国内外各界极大的关注。小核酸药物优势明显，但也面临着诸多挑战。

本期特别邀请了复旦大学生物医学研究院于文强教授、中科院上海药物所安评中心任进研究员和美迪西化学部高级副总裁马兴泉博士，与大家共同探讨“小核酸药物的发展现状与趋势”。

嘉宾精彩报告总览

● NamiRNA，增强子和小核酸药物研发

· NamiRNA的前世今生

· 从NamiRNA到透明质酸与新冠肺炎诊疗

· NamiRNA未来可期

● 小核酸药物分子机制的创新和成药性评价案例分享

· 小核酸药物的优势及挑战

· 小核酸药物成药性研究考量

· 小核酸药物全程式研发平台的建立及新药开发

· 小核酸药物成药性转化和评价策略

● 小核酸类药物研发的药化思考及其研发平台分享

· 小核酸药物优势及管线等研发现状

· 小核酸药物的化学合成与修饰

· 小核酸药物研发技术平台的构建

01 NamiRNA，增强子和小核酸药物研发

于文强教授介绍了NamiRNA的前世今生，分享了团队从NamiRNA的研究中探索发现透明质酸与新冠肺炎发病机制以及开发新冠肺炎有效药物的研究历程，展望了NamiRNA可作为疾病的潜在药物靶标和小核酸药物。

NamiRNA的前世今生

miRNA (microRNA)最早源于1993年Cell期刊发表的文章，文章讲述了美国麻省大学医学院教授Victor Ambros团队发现线虫体内存在名为“lin-4”的小分子非编码RNA，大小为22nt，可抑制 LIN-14 基因的表达，该基因参与调节线虫的发育。2000年，哈佛大学医学院教授 Gary Ruvkun 团队也发现了与 lin-4 类似的名为“let-7”的microRNA，可通过结合mRNA调节线虫发育。截止目前，科学研究已发现1800多种人类的miRNA前体。

miRNA最早的作用机制是抑制mRNA活性，很多研究工作的开展均是围绕着miRNA的抑制作用，然而，于教授团队却在科研过程中发现了miRNA不仅具有抑制mRNA的活性，还有激活mRNA活性的作用。团队研究发现miRNA基因座位置和增强子某些基因富集区域高度重叠，且这些特殊的miRNA多数位于细胞核内，能够在局部和全基因组水平改变靶位点的染色质状态发挥其独特的转录激活作用，激活特定基因的表达，并将该类miRNA分子或现象命名为NamiRNA（Nuclear Activating miRNA）。NamiRNA的激活作用机制得到了多项实验的验证。基于此研究发现，于教授团队提出了NamiRNA-增强子-基因激活小核酸药物作用机制新模式。

从NamiRNA到透明质酸与新冠肺炎诊疗

基于NamiRNA的前期研究工作，于教授团队探索NamiRNA在新冠肺炎诊疗中的应用。团队研究发现，新冠病毒含有人体基因组序列HIS（Human identical sequences ），HIS 序列在灵长类动物体内高度保守，并且HIS的基因组位置与增强子高度重叠，HIS序列周围富集了炎症相关基因，实验验证HIS RNA是潜在的病毒miRNA前体，并且可激活周围基因的表达，如HAS2 and ACE2。此外，团队还发现HIS基因可促进透明质酸合成，透明质酸诱发小鼠肺部磨玻璃病变，已有研究报道透明质酸与CD44结合诱导淋巴细胞死亡，与HABP2受体结合诱导血栓形成。基于这些研究数据和理论基础，团队推测透明质酸与新冠肺炎的密切关系。进一步深入研究，团队发现了新冠肺炎有效药物——羟甲香豆素。羟甲香豆素是一种透明质酸合成酶抑制剂，是一种用于治疗胆道疾病的可口服的处方药，安全性高、毒副作用低。研究表明，羟甲香豆素可作为新冠治疗潜在药物。羟甲香豆素治疗新冠肺炎致病机制和药物干预的研究结果分别在2022年2月和3月发表于柳叶刀子刊和STTT杂志上。团队提出的新冠病毒防治的3-H策略也于2022年5月发表在Mol Biomed上。

目前，大量文章报道透明质酸与新冠肺炎的关系，包括临床表现和细胞因子风暴等，2023年斯坦福大学最新综述文章报道了透明质酸与新冠感染及长新冠的关系，均呈现出透明质酸在新冠肺炎治疗中发挥的重要作用。现有的新冠有效治疗药物，其作用机制多与透明质酸有关。

NamiRNA未来可期

NamiRNA是生物体与环境的重要调控者，也是细胞命运转换的决定者，以往miRNA的研究以抑制mRNA活性为主，于教授团队发现的NamiRNA可激活mRNA的作用机制拓展了miRNA药物开发的新思路，也对以往miRNA抑制作用无法解释的生理病理现象提供了新的研究策略。NamiRNA是未来潜在小核酸药物。

02 小核酸药物分子机制的创新和成药性评价案例分享

任进研究员介绍了小核酸的研发现状、优势及面临的挑战，并分享了小核酸药物成药性考量和全程式研发策略，通过案例展示了小核酸药物临床前成药性评价的关键技术。

小核酸药物的优势及挑战

纵观生物医药发展史，从早期以小分子化药为主导，后来发展了单抗、双抗和ADC等多种抗体药物和基因治疗产品，到现在热门小核酸药物，小核酸药物是发展快速的新型药物，自2006年被授予诺贝尔奖以来，小核酸药物获批上市了多款新药，包括ASO和siRNA，近年来备受国内外各界关注。

与小分子化药不同，小核酸药物是一种RNA药物，其优势在于靶点较多，且特异性强，研发成功率相对较高。但是，小核酸药物仍面临着诸多挑战，主要挑战是药物稳定性和递送问题，小核酸药物的肝外递送仍存在较大困难。此外，小核酸药物的多靶点、药代动力学和不良反应等问题也存在挑战，如不良反应，表现为脱靶、免疫和递送系统等多种因素介导的毒性问题。

小核酸药物成药性研究考量

药物的成药性临床前评价是新药研发的重要环节之一。目前，小核酸药物包括很多分子类型，如ASO、siRNA和miRNA等，不同类型的小核酸药物作用机制不同，其分子特征、设计、化学修饰、递送系统和药代动力学等都有着较大的区别，这些因素直接影响着小核酸药物成药性。

化学修饰是小核酸药物成药性考量的最重要的关键点，现阶段小核酸药物的修饰方案包括核糖2' -甲氧基修饰、核糖2' -氟代或硫代磷酸修饰等多种修饰形式，主要起到改善药物的PK、稳定性和减少免疫刺激等问题。其次是药物递送，现阶段小核酸药物的递送方案主要以脂质纳米粒包载型载体和GalNAc偶联物为主，其他还包括胆固醇脂质修饰、多肽或抗体偶联形式。第三是有效性验证模型，药物临床适用于什么适应症取决于临床前通过疾病模型验证药物的有效性。目前常用的验证模型包括类器官和器官芯片等新兴技术模型，也包括传统的动物模型和体外模型。体外模型如类器官仅可部分评价药效作用，模拟体内的药效作用仍需传统动物模型来验证。第四是药代动力学，主要从给药途径、药物的吸收、分布、代谢和清除几项试验来评价。给药途径不同，药物的吸收、分布、代谢和清除结果也有所不同。目前给药途径主要以静脉注射和皮下注射为主。第五是安全性特征。安全性问题需要关注的是小核酸药物因化学修饰带来的脱靶问题和递送系统带来的免疫炎症反应问题，这些往往是引起人体不良反应的诱因。

小核酸药物成药性除了技术层面的考量，还应关注政策法规相关的临床前评价指导原则，包括ICH和OSWG（The Oligonucleotide Safety Working Group，OSWG）发布的指南，指导原则涉及了临床前评价中的药动学、安全药理学、DMPK等试验内容。其中，药动学主要关注的是小核酸药物的On-Target毒性和Off-Target毒性问题；安全药理学主要关注小核酸药物进入体内对心血管和中枢神经系统的影响，根据小核酸药物的理化特性评估是否需要开展此类研究；DMPK部分可评估小核酸药物药代动力学参数、药物的分布、代谢、分泌和排泄以及药物相互作用等问题。小核酸药物因有脱靶和免疫原性问题，在临床前安全性评价中，最重要评价是多次给药毒性和免疫毒性，目前据相关报道siRNA药物可实现一次给药维持6个月药效。

小核酸药物全程式研发平台的建立及新药开发

任教授带领的安评中心建立了小核酸药物全程式研发和临床前评价平台。包括早期药物发现、成药性转化和筛选以及IND申报临床前评价的平台。早期发现平台主要是靶点发现、机制研究和功能验证。成药性转化和筛选平台主要聚焦于核酸序列的设计与合成、目标序列细胞内的递送和概念验证（POC/PCC）等。临床前评价平台则涵盖了符合IND申报要求的有效性、安全性和药代动力学试验研究。

miRNA是一类长约22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，可调控人体60%蛋白编码基因表达。任教授团队对miRNA是否具有双重或多重调控作用方式，且对这种双重或多重调控机制的广泛性、普遍性及调控模式进行了深入研究。团队研究发现miRNA不仅可在基因转录后起到抑制mRNA作用，在基因转录的过程中也可抑制mRNA。基于此机制研究，团队针对PCSK9靶点，筛选发现了一款名为“miR-552-3p”的miRNA药物，miR-552-3p在PCSK9基因表达的转录中和转录后都呈现出了很好的抑制作用。进一步研究该药物的生物学功能，显示对高脂、高糖和高胆固醇的小鼠具有很强的降糖降脂效果，并通过临床高血糖和高血脂的患者的血清和肝脏组织细胞培养，进一步验证了该类miRNA药物可通过抑制PCSK9靶点发挥降糖降脂疗效。

小核酸药物成药性转化和评价策略

任教授团队构建了小核酸药物成药性转化和评价策略，即从技术层面，建立了完整的临床前成药性评价体系，该体系包括小核酸药物全新作用机制的深入研究，先导分子早期筛选和评价，先导分子的优化和再筛选以及候选分子的初步临床前评价等。

以miRNA药物为例，团队完成了一整套从早期分子设计到临床前评价的研发策略。在化学修饰和序列筛选方面，制定了多种方案，解决了miRNA的脱靶和不稳定问题；药物递送方面，团队采用了GalNac非病毒递送系统，提高了递送效率；有效性评价方面，团队构建了多种体外细胞模型筛选和体内动物模型，能够很好地验证miRNA的有效性和安全性，在动物血液中miRNA抑制靶基因可达50%以上，在肝脏中也可达到75%的抑制作用；药代动力学方面，团队构建了具有良好的阳性和阴性液滴分离的ddPCR检测方法；安全性评价方面，团队开发了一系列安全评价关键技术（GLP-Tox），包括全套非临床安评试验、免疫毒性分析方法和多种动物种属组织交叉反应等试验技术方法。小核酸药物ASO也开展多项包括药代动力学研究和毒性试验等成药性转化和评价研究。

03 小核酸类药物研发的药化思考及其研发平台分享

马兴泉博士介绍了小核酸药物的优势、研发管线及现有药物类型等研发现状，并从药物化学角度分享了小核酸药物的合成和修饰，同时分享了美迪西研发平台的内容及功能。

小核酸药物优势及管线等研发现状

近年小核酸药物研究火热，究其原因在于优势明显，可靶向不可成药的靶点，只需要已知mRNA靶标序列即可获得靶向性的候选药物，可通过特异性修饰提高药物安全性和有效性以及可大规模工业化生产等优点。马博士认为小核酸药物是在遗传物质的根本面解决问题，相较传统小分子药物和抗体药物具有巨大的潜力。

目前全球小核酸药物获批上市近20款新药，246款处于临床开发阶段，22款在临床Ⅲ期研发中，国内也有多家企业在开发小核酸药物。小核酸药物早期开发聚焦在非肿瘤领域，目前治疗抗肿瘤的小核酸药物也在开发中，clinicaltrials.gov披露了15项临床试验，涉及10家企业，研发多数处于临床Ⅰ期和Ⅱ期，最快的已进入临床Ⅲ期。

小核酸药物国际已有研究类型5种，涵盖反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA或miRNA）、适配体（Aptamer）和CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotides）。国内药企也有在开发siRNA和miRNA药物。

小核酸药物的化学合成与修饰

从药物化学的分子量来看，小核酸药物仍属于化药范畴，分子量大小约为几千Da。现有小核酸药物均是经过化学修饰后的药物，如核苷酸间键修饰和核糖修饰，核苷酸间键修饰多为磷酸酯的磷氧键用磷硫键取代，第一代ASO小核酸药物就是磷酸骨架修饰。核糖修饰包括2'-MOE修饰、2'-OMe修饰、2'-F修饰等。ASO多为2'-MOE修饰，siRNA多为2'-OMe修饰和2'-F修饰。目前，小核酸药物的递送系统涵盖了9种方式，包括脂质体纳米粒、GalNAc偶联、Aptamer、外泌体和DNA cage等。

小核酸药物研发技术平台的构建

美迪西构建了小核酸药物研发平台，覆盖了早期药物发现、药学研究和临床前IND评价阶段的药物研究。其中涉及小核酸药物的序列设计、药化合成与修饰和生物分析等。化学合成方面包括核苷酸单体合成、递送系统合成和寡核苷酸偶联物合成等；修饰包括核糖、碱基、骨架和递送系统的修饰，实现了寡核苷酸药物合成全工程化操作，碱基合成共4步：脱保护（Deprotection, DET）、缩合连接（Coupling, CPL）、加帽反应（Capping，CAP）和氧化稳定（Oxidation, OXI），寡核苷酸合成仅需重复上述步骤即可完成。通过该方法合成寡核苷酸药物和siRNA合成均可达到较高纯度，如合成序列为18个碱基的ASO，纯度可达到99.25%以上，siRNA序列21个碱基，纯度可达98.99%。

美迪西目前在开发的小核酸药物有十几项，包括单体改造、递送系统、生物分析及生物体外评价，生物分析涵盖了药代和毒代分析、免疫原性分析和PD或TOX相关细胞因子等研究。平台建立了4年多，构建了150以上的单体合成砌块库，完成2000多个脂质体的合成。

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